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說一說數字PCR的擴增過程

發布日期: 2020-05-13
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  數字PCR是近年來迅速發展起來的一種定量分析技術。與傳統定量PCR技術不同的是數字PCR不依賴于擴增曲線的循環閾值(CT)進行定量,不受擴增效率的影響,也不必采用看家基因和標準曲線,具有很好的準確度和重現性,可以實現定量分析。迄今為止,已有Fluidigm、Bio-Rad等相繼推出了數字PCR儀器,已經在單細胞分析、癌癥早期診斷和產前診斷等研究領域顯示出巨大的技術優勢和應用前景。
  PCR實際上是一個在模板DNA、引物(模板片段兩端的已知序列)和四種脫氧核苷酸等存在的情況下,DNA聚合酶依賴的酶促合成反應,擴增的特異性取決于引物與模板DNA的持異結合。
  整個擴增過程分三步:
  1、變性:使DNA雙鏈解離,形成兩條單鏈;
  2、退火:溫度下降后模板DNA與引物按氨堿基配對原則互補結合,也可能存在兩條模板鏈之間的結合,但由于引物的高濃度、結構簡單等特點,結合主要發生在模板與引物之間;
  3、延伸:在DNA聚合酶及鎂離子等存在的條件下,從引物的3"端開始,結合單核苷酸,形成與模板鏈互補的新DNA鏈。上述幾步為一個循環,從理論上講,每經過1個循環,樣本中的DNA應該增加一倍,新形成的鏈又可成為新一輪循環的模板。第2個循環開始后,模板鏈增加—倍。經過25—30個循環后DNA可擴增10的6次方至9次方倍。
  
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